9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL.

9.2.1 FÍSICOS

Los métodos físicos utilizan técnicas como la micro inyección con una fina aguja de cristal y la electroporación (exposición de las células aun choque eléctrico).

LA MICROINYECCIÓN

Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.

Resulta ser una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica.

LA ELECTROPORACIÓN

Utiliza pulsos eléctricos que abren temporalmente “agujeros” en las membranas de las células, permitiendo insertar el ADN.

9.2.2 QUÍMICOS

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección).

Actualmente uno de los campos de estudio más importantes por lo que se refiere a les técnicas de transferencia de genes, son los estudios realizados con los llamados vectores sintéticos.

Los vectores sintéticos (han tenido una alta eficacia in vitro, pero una baja in vivo) son de producción sencilla, altamente estables, y se pueden conseguir grandes construcciones.

MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO:

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.

MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO:

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol.

MÉTODO DNA DESNUDO:

El DNA desnudo (técnica en fase altamente experimental) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.

MÉTODO PÉPTIDOS FUSIOGÉNICOS:

Los  péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

Estos péptidos fusiogénicos se utilizan para compactar DNA. Y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas.

MÉTODO  DE LIPOSOMAS:

Los liposomas están formados por DNA y lípidos no inmunogénicos cargados positivamente (lípidos cationicos).


Inicialmente se empezó a trabajar con lípidos no inmunogénicosados, ya que la organización de los lípidos en bicapa podría facilitar el paso a través de la membrana citoplasmática. Aunque estos lípidos no englobaban mucho DNA. 

A raíz de esto se crearon los liposomas que superan el problema de la compactación debido a que el DNA se contornea como consecuencia de las cargas positivas de lípidos (en los liposomas DNA está ocho veces más condensados que en  lípidos normales). Además se pretende controlar su destino mediante proteínas en membrana de liposoma. Una característica en común con la anterior es que se forman de forma espontanea si se colocan los dos en un mismo medio.